Ca⁺⁺ Mg⁺⁺- ATP酶活性測(cè)定試劑盒說明書

                                        微量法 100管/48樣

注    意：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-ATP酶廣泛分布于植物、動(dòng)物、微生物和細(xì)胞中，可催化ATP水解生成ADP和無機(jī)磷。

測(cè)定原理：

根據(jù)Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-ATP酶分解ATP生成ADP及無機(jī)磷，通過測(cè)定無機(jī)磷的量來確定ATP酶活性高低。

需自備的儀器及用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體100mL ×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 10mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入6mL蒸餾水充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑三：液體 2mL×1 瓶，4℃保存。

試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存。用時(shí)加入3mL蒸餾水， 4℃保存。

試劑五：粉劑×1瓶, 4℃保存。用時(shí)加入25mL蒸餾水，溶解后4℃保存一周。

試劑六：粉劑×1瓶, 4℃保存。用時(shí)加入25mL蒸餾水，溶解后4℃保存一周。

試劑七：液體25mL×1 瓶，室溫保存。

試劑八：10mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液 10mL×1 瓶，4℃保存。

0.5μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制：將試劑八 20倍稀釋，即取 0.1mL試劑八加1.9mL蒸餾水充分混勻。

定磷劑的配制：按H₂O: 試劑五:試劑六:試劑七=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷劑應(yīng)為淺黃色。若無色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染，定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。

注意：配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。

樣品酶液的制備：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

操作步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至660nm，蒸餾水調(diào)零。

2、酶促反應(yīng)（在EP管中加入下列試劑）

混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其他物種）準(zhǔn)確水浴10min

混勻，8000g，25℃離心10min，取上清液

3、定磷（在EP管或96孔板中加入下列試劑）

混勻，室溫放置30min，在 660nm處，記錄各管吸光值。

注意事項(xiàng)：

1、由于每一個(gè)樣都必須做對(duì)照，本試劑盒100管只能測(cè) 48份Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-ATP酶。

2、此法具有微量、靈敏、快速的特點(diǎn)。所以對(duì)測(cè)定所用試管要求嚴(yán)格無磷。避免磷污染是檢測(cè)成敗的關(guān)鍵。

3、空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只要做一管。

Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-  ATPase活力的計(jì)算：

1、血清（漿）Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-  ATPase活力的計(jì)算:

定義：每小時(shí)每毫升血清（漿）中Ca⁺⁺ Mg⁺⁺- ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。

Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-ATP酶活力（μmol/h/mL）= [C標(biāo)準(zhǔn)管×V總]×（A測(cè)定管-A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷V樣÷T=7.5×（A測(cè)定管-A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-  ATPase活力的計(jì)算：

（1）按蛋白濃度計(jì)算：

定義：每小時(shí)每毫克組織蛋白中Ca⁺⁺ Mg⁺⁺- ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。

Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-ATP酶活力(μmol/h / mg prot)= [C標(biāo)準(zhǔn)管×V總]×（A測(cè)定管-A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷（V樣×Cpr）÷T =7.5×（A測(cè)定管-A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

定義：每小時(shí)每克組織中Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。

Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-ATP酶活力(μmol/h /g 鮮重)=[C標(biāo)準(zhǔn)管×V總]×（A測(cè)定管-A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷(W× V樣÷V樣總)÷T=7.5×（A測(cè)定管-A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

定義：每小時(shí)每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞中Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。

Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-ATP酶活力(μmol/h /10⁴ cell)= [C標(biāo)準(zhǔn)管×V總]×（A測(cè)定管-A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.015×（A測(cè)定管-A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）

C標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.5μmol/mL；V總：酶促反應(yīng)總體積，0.25mL；V樣：加入樣本體積，0.1mL ；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1/6小時(shí)；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。